多光子活体细胞成像

多光子技术是基于多光子激发理论提出的新型光子技术。目前，以双光子技术为代表的多光子技术已经在生物及医学成像、单分子探测、三维信息存储、微加工等领域得到广泛应用。

双光子激发( two-photon excitation, TPE)是最简单的多光子激发( multi-photon excitation, MPE)过程，常用的多光子技术还有三光子成像, 与双光子激发相比,三光子激发更能体现出多光子成像的优势。下图所示为多光子激发过程。

图1、多光子激发物理原理

多光子激发特点有：(1)荧光分子的多光子激发需要的激光波长比单光子长。( 2)多光子激发只产生在焦点附近的一个极小区域中。

多光子技术特点有：(1) 对生物样品的光损伤小。(2)有效观测时间长。 (3)穿透深度深。(4)荧光收集效率高。(5)对探测光路的要求低。(6)适合多标记复合测量。

应用实例：

1、浙江大学钱骏教授课题组和吉林大学路萍教授课题组合作，研制了一种新型纳米探针。通过搭建测试光路，发现在飞秒光的激发下，TPATCN纳米颗粒有着很强的三光子荧光，波长位于红光与近红外区域，这会比蓝绿等波长较短的荧光更易从深层组织中穿透出来。将TPATCN纳米颗粒通过尾静脉注射入小鼠，经过血液循环后可以到达脑血管进行标记。将小鼠置于搭建的三光子荧光成像系统上进行观察，可以看到脑内丰富的血管信息，成像深度达到875 μm。得益于三光子荧光成像的切片能力，通过对脑内不同深度处的血管进行拍摄和重构，还可以进一步得到脑内脉管系统的三维重构。研究团队选择AIE材料作为荧光探针，将激发光波长选择在穿透深度好的近红外成像窗口内，并且采用三光子激发来实现较深的成像深度，同时保持非常好的成像分辨率，这种方法具有普遍适用性，对进行深层组织成像，研究相关病理学信息非常有意义。

图2、三光子荧光纳米探针

2、北京大学信息科学技术学院、区域光纤通信网与新型光通信系统国家重点实验室王爱民副教授课题组与分子医学研究所陈良怡教授课题组合作发明了一种基于贝赛尔光束的新型三光子显微镜。

图3、为小鼠脑海马神经元三光子显微荧光成像

图a，深度为620～680 μm神经元钙荧光活动在贝赛尔光柱模式下可被同时记录；

图b，相应体积内神经元活动的高斯光成像（贝赛尔光模式、高斯光模式的成像时间分别为1 s和60 s）。

上述成果以《快速体成像贝赛尔光束三光子显微镜》为题，在线发表于《生物医学光学快报》。

因为多光子扫描显微镜具有成像穿透深度深、光学三维分辨率高等特点，为实时、原位观察生物活体提供了最佳方法。多光子技术可配合其他技术手段实现多种学科应用，如与荧光探针技术相结合 ,多光子显微镜可以对细胞内的钙离子动态过程进行实时监测、对钙离子浓度进行准确测量；在神经学研究中，Rose等人首次用双光子激发对海马趾神经刺和锥状神经树中钠离子进行了瞬时动态测量；在胚胎与组织学研究中因为胚胎发育本身包含复杂的生命信息，对外界条件十分敏感，共聚焦显微成像往往妨碍胚胎发育，不能得到胚胎正常发育的信息，而多光子成像则非常适合胚胎发育的长期动态跟踪；在生物学研究种，多光子成像可以在不破碎细胞前提下显示基因在生物体内的表达，已广泛应用于基因转染和表达研究；多光子技术可以用来对标记物质的代谢过程进行监测，记录代谢物的分布、代谢速度，从而突破传统的生物化学分析方法，从单个细胞层次实时研究代谢过程，已应用于药物、糖类等物质的代谢研究；同时多光子技术还可以方便地用于对细胞或者组织内某些物质的定点操控。